O Papel dos Padrões Químicos de Referência como Instrumentos Analíticos no Estabelecimento da Qualidade de Materiais Botânicos
– Uma Perspectiva Européia –

Autor: Klaus Reif, Hartwig Sievers and Jens-Peter Steffen
Fonte: HelbalGram 2004, 63, 38-43
Tradução: Antonio Carlos Siani / IBPM

PARTE 2

Padrões de referências

Padrões de referências são substâncias altamente purificadas, usadas para o teste de vários materiais, sejam eles drogas vegetais ou drogas convencionais. Uma pequena quantidade de um padrão de referência é usada como a base para a detecção da presença e da quantidade da mesma substância no material que está sendo testado. Alguns exemplos de padrões de referências incluem ginsenosídeos específicos (ex.: Rg1, Rb1), do ginseng asiático (Panax ginseng C. A. Meyer, Araliaceae) ou ginseng americano (P. quinquefolius L., Ginkgoaceae), hypericina ou hyperforina na St. John?s wort (Hypericum perforatum L., Clusiaceae), etc. Teoricamente, padrões de referências puros podem ser desenvolvidos pela extração e isolamento nos próprios laboratórios de uma companhia, mas a tecnologia e os custos para isso podem inviabilizar o processo. A maioria dos laboratórios obtém substâncias de referências a partir de (1) empresas especializadas na venda de materiais químicos para laboratório, incluindo padrões de referências, reagentes e outras especialidades químicas; ou (2) diretamente das poucas empresas que se especializaram na produção e venda de padrões de referências de produtos vegetais. A pureza destas substâncias pode variar, ao menos que sejam produzidas de acordo com os padrões químicos corretos.

Substâncias de referências vegetais

Os padrões de referências vegetais podem ser produzidos de duas maneiras: (1) pelo isolamento a partir de fontes naturais, a partir do material vegetal e (2) por síntese parcial ou total, isto é, artificialmente, via processo químico. De maneira geral, qualquer substância que pode ser separada de sua matriz natural com suficiente resolução cromatográfica em uma escala analítica, poderá ser isolada da mesma fonte em quantidade suficiente para ser utilizada como padrão de referência. No entanto, a baixa concentração de muitas substâncias de interesse dentro das fontes vegetais preferidas pode tornar o isolamento demasiadamente caro e, por isso, inviável financeiramente. Em alguns casos, contudo, o alto teor da mesma substância pode ser encontrado em outras fontes vegetais que não a planta de interesse.

Em princípio, a síntese química é uma alternativa. Porém, muitas substâncias vegetais possuem estruturas muito complexas e uma alta especificidade com respeito aos possíveis isômeros estereoquímicos, fato que pode complicar e encarecer a síntese. Por isso, apesar do enorme progresso da química sintética, a síntese ainda é – por razões econômicas – restrita a pouquíssimos casos em que se necessita de um determinado composto apenas para propósitos analíticos. Exemplos recentes de substâncias de referências obtidas sinteticamente são a rubiadina e a lucidina, para o suco de nona ("noni"; Morinda citrifolia L., Rubiaceae). Estas antraquinonas tóxicas ocorrem em partes da planta nona, mas não em seus frutos e, por isso, são usadas para checar a qualidade do processo de produção e o produto final. Elas são facilmente acessíveis por rotas sintéticas, embora o isolamento seja difícil, devido à pequena quantidade presente nas fontes naturais. Também para uma substância de referência amplamente conhecida da Hypericum perforatum L. (ver Tabela da Parte 1; boletim anterior) o caminho sintético é uma boa alternativa ao isolamento.

Considerando as substâncias de referências como a base para estabelecer a qualidade de medidas analíticas (e por inferência, da qualidade do material vegetal), é evidente que é de crucial importância a qualidade dos próprios padrões de referências, no sentido de promover um nível confiável e documentado de qualidade, segurança e eficácia da matéria-prima e produtos vegetais. Embora atualmente muitas substâncias vegetais estejam disponíveis comercialmente, os produtos analíticos comerciais nem sempre são obtidos a partir de materiais de alta qualidade.

[Aqui, o artigo original traz uma ilustração sobre dois lotes comercialmente disponíveis de hiperforina (a substância marcadora floroglucinol da erva de São João - "St. John's wort"), ambos rotulados como contendo teor acima de 90% de pureza. A análise por CLAE, realizada pelos autores do artigo, demonstra que ambos apresentam perfis muito diferentes. Um deles é considerado adequado às especificações que traz no rótulo, mas o outro apresenta uma série de picos, onde o presumível sinal da hiperforina não corresponde nem mesmo ao maior sinal do conjunto de picos.]

Quando se objetiva manipular e usar padrões químicos de referência, é necessário se proceder uma análise dos diferentes tipos de substâncias que estão comumente disponíveis. Esta apreciação é importante tanto por razões econômicas, quanto para se certificar de que o padrão de referência é de suficiente qualidade para se atingir o uso a que se propõe. Em suma, alguns procedimentos ou processos em teste podem não exigir um material que seja 99,9% puro, ao passo que isto pode ser necessário para outros. Deve-se considerar que pureza e custos estão diretamente relacionados: quanto mais puro o material maior o seu custo. Daí, utilizar um padrão mais puro, quando um material menos puro poderia funcionar adequadamente, não é uma decisão economicamente adequada. Em contrapartida, usar um material menos puro, quando uma substância mais pura é mais apropriada, pode invalidar séries inteiras de análises dispendiosas.

De acordo com a Organização Mundial de Saúde (OMS), há dois diferentes tipos de substâncias químicas de referências que podem ser distinguidas segundo a conexão com a quantificação das substâncias em um produto vegetal: substâncias de referências primárias e substâncias de referências secundárias. ²

"A designada substância de referência primária é aquela que é amplamente reputada como possuindo as qualidades apropriadas dentro de um contexto específico e cujo valor é aceito sem requerer comparação com uma outra substância química".2 Isso significa que apenas substâncias altamente purificadas, com identidade, pureza e teor definidos e documentados, podem ser utilizadas como substâncias de referências primárias. Essencialmente, a substância de referência primária estabelece o valor fundamental para um método analítico específico, do qual dependem todas as outras definições de teores.

A OMS estabelece que "uma substância de referência secundária" é uma substância cujas características são atribuídas e/ou calibradas por comparação com uma substância de referência primária".2 Esta comparação permite validar a definição do teor de uma substância particular sem gerar dados completos sobre sua identidade, pureza e teor da substância em si. Isso é somente possível quando uma substância de referência primária está disponível para a calibração. Em comparação com o campo de medidas de dimensões físicas, uma onça (sistema avoirdupois de medida) pode apenas ser definida como 0,0283 de um quilograma, quando a própria massa de um quilograma já está definida. As substâncias de referências secundárias são chamadas freqüentemente de "padrões operacionais" (working standards) – um termo que indica sua importância no trabalho de rotina de um laboratório.

A USP e a EP oferecem substâncias de referências primárias para uso com métodos especificados em suas respectivas monografias. Do ponto de vista regulatório, a despeito da alta pureza, estes padrões farmacopéicos não são válidos para propósitos analíticos, além do uso nos métodos descritos nas respectivas monografias.

Finalmente, qualquer outra substância química com estrutura conhecida pode ser usada como um padrão para teste de identidade, embora seus teores não estejam definidos. Por exemplo, em uma análise de perfil químico (fingerprint) por cromatografia de camada fina (CCF), a comparação da constituição de uma preparação, com substâncias marcadoras, revela se as substâncias desejadas estão ou não presentes.

Definindo uma Substância Química de Referência

Neste ponto, faz-se necessário discutir a determinação do teor de uma substância de referência, sendo esta um pré-requisito essencial para seu uso apropriado em análise quantitativa. Infelizmente, muitos usuários de padrões de referências não estão conscientes da temeridade de se usar uma substância de referência – o teor do qual não é claramente definido – para a quantificação de um componente.

O primeiro passo, ao definir uma substância química de referência, é sempre sua identificação. Hoje, a espectroscopia de ressonância nuclear (RMN) e a espectrometria de massas (EM) são as ferramentas mais importantes para a elucidação estrutural (determinação tridimensional das estruturas químicas de uma molécula específica). O segundo passo é examinar sua pureza. Novamente, isso requer uma combinação de diferentes métodos. A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) ou a Cromatografia de Gás (CG) são técnicas típicas, usadas para procurar por impurezas orgânicas, assim como a Cromatografia de Camada Fina (CCF). Os teores de água e de solventes residuais precisam ser estabelecidos e a análise elementar revelará se há ou não impurezas inorgânicas presentes que devam ser consideradas. Em alguns casos particulares, os testes de pureza podem incluir outros métodos, tais como rotação óptica ou ponto de fusão. Então, como um terceiro passo, o conteúdo químico é tipicamente determinado, usando os métodos de CLAE ou CG. Contudo, o usuário da substância de referência deve estar ciente de que um teste para os conteúdos químicos, com base apenas em CLAE ou CG não é suficiente, desde que estes métodos analíticos não são indicativos do valor absoluto, isto é, não detectam todas as possíveis impurezas orgânicas. No sentido de superar este problema, é amplamente aceito que se estabeleçam os conteúdos com base em ao menos dois métodos independentes para certificar-se de que o valor assinalado é o valor "verdadeiro". Até que as quantidades de impurezas totais sejam subtraídas desse valor, não é possível se falar em um conteúdo definido de um padrão de referência (ex., para uma substância de referência primária).

Por conta destas medidas demoradas e complexas, "a produção, validação, manutenção e distribuição de substâncias químicas de referência resultam numa tarefa morosa e dispendiosa".² Para o usuário de substâncias de referências, esta assertiva significa simplesmente que os padrões de referências, especialmente os padrões de referência verificados como tal, são materiais caros e é de extrema importância saber otimizar os seus usos.

Na maior parte do trabalho cotidiano de um laboratório, o procedimento ideal para a quantificação de uma substância em uma mistura – comparação com uma substância de referência verificada – não é prático, devido aos altos custos dos padrões. Por isso, o procedimento mais comum é comprar uma pequena quantidade de uma substância de referência primária comercialmente disponível ou gerar sua própria substância primária, e então calibrar os conteúdos de lotes maiores (isto é, menos puros) da mesma substância, por comparação com a substância primária, produzindo dessa maneira, padrões secundários ou padrões operacionais. Este processo estabelece um conteúdo definido para o padrão operacional. Esta abordagem economiza recursos porque a quantidade de substância de referência primária necessária para a comparação é menor, e porque apenas um único método analítico é geralmente requerido para atribuir o valor do conteúdo ao padrão secundário.

No entanto, alguns perigos deste procedimento devem ser considerados cuidadosamente. Usualmente, as substâncias de referências são utilizadas por um longo período de tempo; por exemplo, em análises de rotina ou em testes de estabilidade. Mas o conteúdo de uma substância de referência depende de fatores variáveis:

Pode ocorrer decomposição, especialmente se a substância não estiver apropriadamente protegida contra oxigênio e/ou luz.
O teor de água e os teores de outros solventes residuais podem variar, no caso de a substância referência não ser armazenada em frascos adequadamente isolados do ar.
Conseqüentemente, é essencial a armazenagem de substâncias de referências sob condições definidas, que incluem locais frios, secos e escuros. Contudo, todos esses cuidados não eliminam a necessidade de que sejam re-testadas regularmente.

Ainda deve-se considerar que, mais cedo ou mais tarde, um lote de substância de referência será esgotado completamente. Em vista desta inevitabilidade, todo lote novo deverá ser testado por comparação direta com o lote precedente. Além disso, é importante requisitar um novo lote de material de referência antes que o lote prévio tenha se esgotado. Na opinião do autor, este é o único meio de se estabelecer comparabilidade e rastreabilidade de valores de conteúdos a longo-prazo.

Muito freqüentemente, os usuários acabam por descobrir por si mesmos todos os requerimentos referentes ao uso metodologicamente correto das substâncias de referências. Na opinião do autor, deveria ser facultado ao usuário escolher se eles querem eles próprios executar todos os procedimentos descritos acima ou se preferem, simplesmente, adquirir um padrão operacional proveniente de algum fornecedor reputado que ofereça, a longo-prazo, a rastreabilidade dos valores calculados de conteúdos.

Um fornecedor de substâncias de referência poderia oferecer (1) "substâncias primárias" ou substâncias verificadas com um teor definido e a completa documentação disponível e (2) padrões prontos-para-uso, para os quais a calibração contra a substância "primária" é rastreável e claramente documentada.

Pelo fornecimento desta documentação, os requisitos referentes a (1) ensaios de estabilidade, (2) exames de impurezas, (3) definição de condições de estocagem e (4) documentação de todos estes procedimentos são minimizados para os usuários. Conseqüentemente, os usuários podem no final, alcançar o que eles realmente precisam: substâncias de referências, caracterizadas por um conteúdo definido, a um custo razoável e rastreável por um valor "primário" básico, por um período suficiente de tempo. Desta maneira, os fabricantes de produtos vegetais podem ajudar a certificar que o teste analítico – que provavelmente será exigido para muitos produtos sob a regulação de BPM – estará embasado em substâncias de referências de alta qualidade. Na opinião destes autores, este fato resultará, em última instância, no aumento da produção de produtos vegetais com qualidade confiáveis.

Referências

Current Good Manufacturing Practice, Packaging or Holding Dietary Ingredients and Dietary Supplements: Proposed Rule. Federal Register vol. 68, No. 49, Docker No. 96N-0417. Washington, DC: Food and Drug Administration. March 13, 2003; 12158-12263.
General guidelines for the establishment, maintenance and distribution of chemical references substances, WHO Technical Reports Series, No. 885, 1999 (Annex 3). Available at http://www.who.int/medicines/organization/qsm/activities/qualityassurance/
pharmacopea/who-trs-885annex3.html.
Note for Guidance on quality of herbal medicinal products, Committee for Proprietary Medicinal Products (EU) /QWP/2819/00. Available at http://www.emea.eu.int/index/indexh1.htm (Homepage of the EMEA Herbal Medicinal Products Working Party [HMPWP]).
Note for Guidance on specifications: test procedures and acceptance criteria for herbal drugs, herbal drug preparations and herbal medicinal products, Committee for Proprietary Medicinal Products (EU) /QWP/2820/00. Available at http://www.emea.eu.int/index/indexh1.htm (Homepage of the EMEA Herbal Medicinal Products Working Party [HMPWP]).
U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration Center for Drug Evaluation and Research (CDER). Guidance for Industry: Botanical Drug Products. Jun, 2004. Available at http://www.fda.gov/cder/guidance/index.htm.